Лабораторная работа No 7.
Изучение свойств фотосинтетических пигментов
Цель работы: ознакомиться с методами экстракции пигментов и с их
химическими свойствами.
Задание 1. Химические и оптические свойства пигментов листа
В процессе фотосинтеза высших растений участвуют две группы пигментов: зеленые – хлорофиллы а и b; желтые – каротины и ксантофиллы. Мы познакомимся с методом выделения пигментов, разделения по методу Крауса, с основными химическими и оптическими свойствами пигментов. Работа состоит из отдельных этапов, которые выполняют в приведенной ниже последовательности.
- Получение спиртового раствора пигментов
С этой целью можно использовать как сухие листья, так и свежий растительный материал. При работе с сухими листьями рекомендуется увлажнить их перед экстракцией пигментов. При работе с сырым материалом удобны листья герани, гороха, фасоли.
Для получения большого объема экстракта употребляют высушенные листья крапивы, которые помещают в коническую колбу вместимостью 200 мл и обваривают кипятком, затем воду сливают. В колбу приливают 100 мл этилового спирта, закрывают ее пробкой с обратным холодильником и ставят на 5 минут на баню с кипящей водой для экстрагирования пигментов. Затем содержимое колбы охлаждают и раствор осторожно декантацией сливают через воронку со складчатым бумажным фильтром. Отфильтрованный раствор используют в последующих опытах. Хранить растворы пигментов следует в темноте в холодильнике.
Ход работы: 1–2 г листьев герани поместить в фарфоровую ступку, добавить немного кварцевого песка (для лучшего измельчения растительных тканей) и щепотку мела (для создания нейтральной или слабощелочной реакции среды). Листья растереть до однородной массы, в которую добавить 10–15 мл 96%-ного этанола. После тщательного перемешивания гомогенат отфильтровать в пробирку через бумажный фильтр с белой лентой. Чтобы жидкость при выливании из ступки не стекала по стенке, приставить стеклянную палочку к носику ступки, смазанному снаружи вазелином. Ступку и пестик можно ополоснуть несколькими миллилитрами этанола, который надо сливать на этот же фильтр. Работа носит качественный характер; поэтому можно не добиваться полного переноса пигментов в раствор. Если первые порции фильтрата получились мутными, их снова надо профильтровать, не меняя фильтра. Полученный экстракт зеленого цвета пригоден для последующих опытов. - Разделение пигментов по методу Крауса
Метод основан на различной растворимости пигментов в спирте и бензине, которые при сливании не смешиваются, образуя два слоя: верхний – бензин; нижний – спирт. Эмпирическая формула хлорофилла a – С55Н72О5N4Mg, хлорофилла b – С55Н70О6N4Mg. Хлорофилл является сложным эфиром дикарбоновой кислоты хлорофиллина и двух спиртов – метанола и фитола. Фитол имеет длинную углеводородную цепочку (С20Н39), которая и определяет гидрофобность молекулы хлорофилла. Он лучше растворяется в гидрофобном растворителе – бензине. Каротин, будучи углеводородом (С40Н56), также обладает гидрофобными свойствами и имеет большое сродство с бензином. Ксантофиллы – спирты (С40Н56О2), и поэтому они лучше растворяются в этаноле, чем в бензине.
https://studfiles.net/download.php?id=6321361&code=ceb4fe7793cafaa67b1e2def0484fd99&download-status=process0001 07.07.2019, 9D38 Стр. 1 из 4 Ход работы: в пробирку налить 2–3 мл спиртовой вытяжки пигментов и добавить 3–4 мл бензина Калоша (вместо бензина можно использовать петролейный эфир). Пробирку встряхнуть и дать отстояться содержимому. Происходит отслоение эмульсии. Сверху собирается бензин с перешедшими в него хлорофиллами, которые окрашивают данный слой в зеленый цвет. Каротин также находится в бензине, но его желтая окраска маскируется хлорофиллом. Нижний спиртовой слой содержит пигмент ксантофилл, который окрашен в желтый цвет.
Если разделение пигментов происходит недостаточно четко, в пробирку надо добавить 1–2 капли воды и снова сильно встряхнуть ее. Избытка воды следует избегать, так как может произойти помутнение раствора.
Результат работы зафиксировать в виде рисунка.
В заключение следует дать объяснение различной растворимости пигментов в спирте и бензине. - Омыление хлорофилла щёлочью
Сложные эфиры способны к реакции со щелочью (реакция омыления), при этом их молекула расщепляется на кислоту и спирт. Из пигментов листа омыляется только хлорофилл, от молекулы которого под влиянием щелочи отщепляются метанол и фитол:
Образующаяся при омылении натриевая соль хлорофиллиновой кислоты сохраняет зеленую окраску, но приобретает гидрофильные свойства, а значит, и большее сродство к спирту. Желтые пигменты при действии щелочи не изменяют своей химической природы.
Ход работы: в пробирку с 2–3 мл вытяжки пигментов добавить 1–2 капли 20%-ного раствора NaОН. Пробирку нагреть на водяной бане до закипания в ней раствора. После охлаждения добавить в пробирку 2–3 мл бензина и 2–3 капли воды (для лучшего разделения смеси). Затем содержимое пробирки сильно встряхнуть и дать отстояться. В пробирке должны присутствовать два слоя: нижний (спиртовый), окрашенный в зеленый цвет; верхний (бензиновый), окрашенный в желтый цвет. В спиртовом слое растворены натриевая соль хлорофиллиновой кислоты и ксантофиллы, окраска которых маскируется хлорофиллом. В бензиновом слое растворен каротин.
В конце работы зарисовать картину разделения пигментов после омыления хлорофилла.
В заключение необходимо объяснить распределение окраски в спиртовом и бензиновом слоях. - Получение феофитина и обратное замещение водорода атомом металла
Хлорофилл относится к Mg-порфиринам. Главной частью его молекулы является порфириновое ядро, состоящее из четырех пиррольных колец.
Их вершины с атомами азота направлены к центру порфиринового ядра и взаимодействуют с атомом магния, занимающим центральное положение. Магний в порфириновом ядре удерживается непрочно и при осторожном воздействии сильных кислот может быть замещен на два атома водорода.
Водородзамещенный хлорофилл называется феофитином и имеет бурый цвет:
https://studfiles.net/download.php?id=6321361&code=ceb4fe7793cafaa67b1e2def0484fd99&download-status=process0001 07.07.2019, 9D38 Стр. 2 из 4 Водород феофитина можно заменить снова металлом, если подействовать солями меди или цинка; при этом восстанавливается зеленая окраска пигмента. Следовательно, цвет хлорофилла зависит от наличия металлорганической связи в молекуле.
Процесс феофитинизации часто наблюдается в природе и свидетельствует об увеличении проницаемости живых мембран, а значит, о повреждении и гибели клеток.
Ход работы: в две пробирки налить по 2–3 мл спиртового раствора пигментов и прибавить по одной-две капли 10%-ной соляной кислоты. Зеленая окраска раствора переходит в бурую, так как образовался феофитин. Одну пробирку оставить для контроля, во вторую внести небольшой кристаллик уксуснокислой меди и нагреть раствор на водяной бане до кипения. Бурый цвет раствора изменится на зеленый, так как произошло образование хлорофиллпроизводного меди:
В конце работы зарисовать картину разделения пигментов после омыления хлорофилла.
В заключение необходимо объяснить изменение окраски.
Задание 2. Разделение фотосинтетических пигментов методом бумажной хроматографии
Разделение пигментов в настоящем задании основано на различной скорости их продвижения с растворителем. Это обусловлено различной адсорбцией пигментов на бумаге и частично – разной растворимостью в бензине и массой молекул. Эмпирическая формула хлорофилла a – С55Н72О5N4Mg, хлорофилла b – С55Н70О6N4Mg. Каротин (С40Н56) имеет большое сродство с бензином. Ксантофиллы (С40Н56О2) лучше растворяются в этаноле, чем в бензине.
Ход работы: приготовить ацетоновую (или спиртовую) вытяжку из свежих листьев любых растений. Навеска растительного материала должна составлять 2–3 г, объем ацетонового экстракта – 25 мл (100%-ный ацетон).
Из хроматографической бумаги вырезать полоску шириной 1,5–2,0 см, длиной 20 см. Держа полоску вертикально, опустить ее кончик на несколько секунд в вытяжку пигментов, налитую в бюксу. При кратковременном погружении вытяжка поднимается по бумаге на 1–1,5 см.
Затем бумагу высушить в токе воздуха и снова погрузить в раствор пигментов. Эту операцию повторить 5–7 раз, пока у верхней границы не образуется полоска ярко-зеленого цвета. После этого нижний конец хроматограммы опустить на несколько секунд в чистый ацетон, чтобы все пигменты поднялись на 1–1,5 см. Таким образом, на бумаге получают окрашенную зону в виде зеленой полоски, где сконцентрирована смесь пигментов, которую необходимо разделить.
https://studfiles.net/download.php?id=6321361&code=ceb4fe7793cafaa67b1e2def0484fd99&download-status=process0001 07.07.2019, 9D38 Стр. 3 из 4 Рис. 1. Вид хроматограммы с разделенными пигментами
Хорошо высушенную хроматограмму (до исчезновения запаха ацетона) поместить в строго вертикальном положении в камеру, на дне которой находится чашка Петри с растворителем (смесь бензин:бензол – 1:2), так, чтобы растворитель не касался зоны пигментов. Камеру герметично закрыть. Через 10–15 мин растворитель поднимется на 10–12 см. Смесь пигментов при этом разделится на отдельные компоненты в виде полос, расположенных в следующем порядке: первый снизу – хлорофилл b, над ним – хлорофилл a, затем – ксантофилл (рис. 1). Каротин продвигается вместе с фронтом растворителя быстрее других компонентов, и зона его на бумаге располагается выше всех других пигментов.
Полученную хроматограмму приклеить в тетрадь, обвести зоны пигментов карандашом и подписать.
https://studfiles.net/download.php?id=6321361&code=ceb4fe7793cafaa67b1e2def0484fd99&download-status=process0001 07.07.2019, 9D38 Стр. 4 из 4